使用ACQUITY UPC²超高效合相色谱快速分离营养保健品中的维生素K1异构体和维生素K2

来源：沃特世公司　发布时间：2015-12-09

天然产物中的维生素K1（叶绿醌）主要以反式结构存在，而膳食补充剂通常使用合成的维生素K1，其中可能含有相当数量的顺式结构。反式维生素K1具有生物活性，而顺式K1并不具备。目前用于分离维生素K1异构体的HPLC方法需要使用C30色谱柱。HPLC方法的典型运行时间大约为20 min，并且有些方法还需要使用氯化溶剂。
超高效合相色谱（UltraPerformance Convergence Chromatography，UPC²）是一种分离技术，它利用压缩CO2处于或接近超临界状态时的特有属性（即低粘度和高扩散性）以及亚2 μm颗粒填充色谱柱，显著提高了分离效率、速度和选择性。
本应用纪要介绍了一种快速分离维生素K1反式和顺式异构体以及四烯甲萘醌（MK-4，维生素K2的一种常见形式）的方法，该方法使用UPC²和ACQUITY UPC² HSS C18SB色谱柱，在3 min内即可完成分离。维生素K1异构体和MK-4的结构如图1所示。与目前所使用的基于LC的维生素K1反式和顺式异构体分析方法比相比，此UPC²方法更加快速、简单（无需使用C30色谱柱），并且所消耗的有机溶剂更少。

使用UPC²和单个UPC² HSS C18SB色谱柱（3.0×100 mm，1.8 μm）在3 min内实现了维生素K1顺式和反式异构体以及MK-4的基线分离。如图2所示，顺式结构的维生素K1首先被洗脱，接着是反式结构，最后是MK-4。关键对（顺式和反式维生素K1）之间的USP分离度为1.7（表1）。在梯度程序中，在0.5% B中初始2 min的等度洗脱对于顺式和反式维生素K1的基线分离是非常必要的。将流动相B的输送体积精确控制在0.5%对于关键对的分离至关重要。ACQUITY UPC²系统是目前市场上唯一能够提供这种水平的精确控制的SFC系统。等度保持阶段之后，本研究采用了流动相B从0.5%增加至20%的通用梯度。此梯度范围可在应用中根据实际的目标维生素K2同系物的保留时间作出相应的修改。

图2. 维生素K1异构体和MK-4混合标准品的叠加色谱图（n = 10）。
本研究还涉及MK-4，因为它是维生素K2的一种常见形式，并且是与维生素K1结构最相近的一种维生素K2。其它形式的维生素K2（如MK-7）具有较长的侧链，在色谱柱上的保留时间更长。因此它们能够很容易地与维生素K1分离。总运行时间为4 min，比使用C30色谱柱的HPLC方法的典型运行时间至少快五倍。每一次进样的有机溶剂消耗量少于1 mL，这只是使用LC方法时典型溶剂用量（15至30 mL）的一小部分。

表1. 维生素K混合标准品的重复分析结果（n = 10）。
混合标准品的十次重复分析表现出优异的重复性（表1）。信噪比为10时，顺式维生素K1、反式维生素K1和MK-4的定量限（LOQ）分别为0.06、0.06和0.04 μg/mL（表2）。这些化合物都获得了良好的线性（R2 >0.998）（表2）。市售维生素K补充剂的分析也表现出良好的重复性和分离度（图3）。经测定，在这种产品中，顺式K1占总维生素K1的11.2%（表3）。

表2. LOQ和线性。

图3. 维生素K片剂重复分析的叠加色谱图（n = 3）。

表3. 维生素K补充片剂的重复分析结果（n = 3）。
利用UPC²技术，可在3 min内使用ACQUITY UPC² HSS C18SB色谱柱快速分离顺式和反式维生素1异构体及MK-4。分析速度比目前所使用的HPLC方法快至少五倍，并且无需使用特殊的C30色谱柱。此UPC²方法具有出色的分离选择性、分离度、灵敏度和重复性，而且所使用的溶剂远远少于HPLC方法。UPC²可以用于食品成分检测实验室的常规维生素K分析，它能提高实验室通量、降低运行成本。